引物设计的10款软件:经典款＋在线款

引物设计软件

本文授权转载自解螺旋·临床医生科研成长平台

提及PCR，这可是实验室里的老朋友了。作为科研升级打怪之路上的第一道最基本关卡，初踏进科研界的实验狗们，又有哪个没有与之打过交道？可饶是如此，不少菜鸟在闯关时仍会被摔的鼻青脸肿，原因无他，引物设计不好之过矣。

显然，欲过此关，则必先通过引物设计的试炼。好在网上流传着各类PCR引物设计软件，各显神通后可快速为大家设计出最佳引物，以助大家一臂之力。而本文也搜集一箩筐各具特点的引物设计软件，大家按自己的需要进行选择即可。

经典款

1.Primer Premier

Premier是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件，应该是使用范围最广的一款软件了。主要界面有序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和 Motif 分析窗口。

Primer Premier软件的主要功能分四种，即引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析功能。前三种为其主要功能。

此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列"朗读"、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。（文章链接：PrimerPremier 6安装、破解、引物设计实操攻略）

2.Oligo7

该软件主要应用于核酸序列引物分析设计，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列。作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，其主要功能包括：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。（文章链接：干货 | Oligo设计引物，就是这么简单）

3.Beacon Designer

Beacon Designer是一款功能强大且简单易用的Real-time PCR引物设计的必备武器。它可在目的基因的任意位置中定位引物，比如跨内显子-内显子或外显子-外显子设计引物，适用于SYBRGreen试验设计。此外，它可用于HRMA试验设计、双标签探针设计（如TaqMan®探针、分子信标、Scorpions引物和探针、FRET探针）。

在线款

1.NCBI的Primer-Blast

通常用另一个站点或工具设计好引物后，还得用BLAST进行引物特异性验证。但这个工具整合了目前流行的Primer3软件，同时也能通过NCBI的Blast进行引物特异性的验证，比较快捷方便。

且该工具还可针对某一特定剪接变异体基因来设计引物——这是用来衡量基因在特定组织中特异性表达的重要特征。此外，Primer-BLAST有许多改进的功能，比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

Primer-Blast的界面包括4个部分：PCRTemplate（模板区），Primer Parameters（引物区），Exon/intronSelection（外显子内含子设置）和specificity check（特异性验证区）。

网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者直接从Blast主页（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到。

2.Primer3Plus

Primer3是一个非常简单却高效的引物设计在线软件。你只需在目标序列中粘贴DNA序列后点击搜索即可。其中，可通过多种方式来对结果进行筛选，包括PCR产物的大小、引物大小、Tm范围和其他参数。同样，还可使用Primer3来设计用于PCR-ELISA的杂交探针和其他基于探针的PCR引物设计。

另外，严格的qPCR引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子，最好在3‘端设计引物，产物的长度在300bp以内等。本在线软件可满足qPCR引物设计的要求。

网址：http://www.primer3plus.com/

3.BathPrimer3.0

BathPrimer3.0是由加州大学戴维斯分校的研究人员设计的一个基于Primer 3为核心开发的引物设计工具，可设计多种引物，包括通用引物，SSR引物设计和SSR检测和SNP基因分型引物，以及DNA测序引物，当然它最大的特点是可以一次设计500条序列引物，并且是在线和完全免费的，而且速度也是杠杠的。

网址：

https://wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/

4.The PCR Suite

这是基于Primer3的基因引物设计的四套程序，可用于设计重叠引物（Overlapping Primers），即在一个序列中创建多个重叠的PCR引物；只需要一个包含目的基因的GenBank文件，即可在基因组序列的外显子周围设计引物（Genomic Primers）、每个SNP上设计引物（SNPPrimers ）、在开放阅读框架上设计引物（cDNAPrimers）

5.Primerbank

哈佛大学的一个qPCR引物数据库，目前有超过20万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为82.7%。尽量选择这种验证过的qPCR引物，qPCR品质比较有保障。（文章链接：干货 | PCR引物设计，3款在线软件就能搞定！）

网址：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

6.PrimerX

PrimerX可用于自动设计用于定点诱变的诱变PCR引物，节省时间提高效率。基于你所输入的序列，PrimerX将模板DNA序列与已经包含所需突变的DNA或蛋白质序列进行比较。然后通过计算编码该突变的适当长度的所有可能的寡核苷酸序列，并遵循指定的指令来产生正向引物序列。最后，PrimerX产生相应的反向引物序列，并计算其他必需信息，如每个引物对的解链温度和GC含量。

网址：http://bioinformatics.org/primerx/

7.BiSearch

特别推荐该软件设计用于扩增高度冗余的亚硫酸氢盐处理的序列的引物。ePCR工具可快速检测cDNA文库和天然或亚硫酸氢盐处理的基因组中的错配位点和替代PCR产物。

网址：

http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch

快速获取通道

辣么多的引物设计软件，闹哄哄、你方唱罢、我登场，倒是给人一种乱花渐欲迷人眼的感觉。可即便如此，有些被绕花眼的小伙伴依然在PCR之海中浪不起来，被PCR引物狠狠地拍在岸上。

而这归根到底是因为他们忽略了一点——无论自己设计引物还是交给公司设计引物，只要是设计，其过程就是探索；只要是探索，就必然伴随着不确定性。并且任何引物设计软件都只是依据相应参数、算法来进行计算、预测，因此得到的引物仅在理论上是最优的，并不代表实际实验一定能出结果。

因此，一对引物究竟好不好用，还是需要通过实验来验证的，所谓“实践是检验真理的唯一标准”。而就小编而言，私认为获得良好PCR引物比较科学的流程，应如下图所示：

图中，获取引物的四种方法：颜色越偏绿，实验成功率越高；颜色越偏红，实验成功率越低，但得到引物序列的概率越高。

显然，每个小伙伴做实验都是依托于实验室这个大平台，那么很有可能你所研究的基因是课题组以前做过的，甚至还有可能发过论文的。都说人有一张嘴，除了吃，就是说。此时，需要引物的你大可以直接询问自家的师兄师姐。掌握要诀：师妹靠卖萌，师弟靠干活~

另外，书中自有黄金屋，这话也是很有道理的。要研究某个基因，怎能不读几篇相关文献呢？而且很有可能某篇文献中就已经提供了该基因的荧光定量引物，而该引物还是经过作者验证和期刊评审机构核实过的，八成是可以给你带来完美的结果。

如果你研究的基因比较小众，茫茫文献中很难钓到提供目的基因引物序列的文章，那就只能转战数据库了。比如上文推荐的数据库PrimerBank，就可以提供相关基因的qPCR引物。但如果上述三种方法都没能成功，小伙伴们就不要再抱着侥幸心理了，还是老老实实设计引物吧。

／End.